Categories: СПРАВКА

Методические указания по проведению внутреннего контроля точности исследования рк в лабораториях

методические указания по проведению внутреннего контроля точности исследования рк в лабораториях

11. Субкультура — культура бактерий, полученная путем пассажа через полноценные питательные среды.

Методические указания МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 2001 г.) (с изменениями и дополнениями)

Питьевая вода и водоснабжение населенных мест

2.1.4. Методические указания МУ 2.1.4.1057-01
«Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды»
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 2001 г.)

С изменениями и дополнениями от:

1. Область применения

Методические указания «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» (далее — методические указания) предназначены для лабораторий, выполняющих санитарно-микробиологические исследования воды при обеспечении государственного санитарно-эпидемиологического и производственного контроля качества воды: питьевого, хозяйственно-бытового водоснабжения, водных объектов рекреации, спорта и др.

Настоящие методические указания являются первым опытом обобщения научных данных и практических рекомендаций международных и отечественных документов в этой области, а также результатов их использования в производственных условиях.

Авторы рассматривают представленный документ как один из этапов совершенствования организации внутреннего контроля в отношении качества микробиологических исследований.

Методические указания представляют собой свод отдельных методик и процедур контроля качества, выполняемых на различных этапах микробиологических исследований, и направлены на их унификацию в целях получения надежных и сопоставимых результатов анализа.

Данные методические указания являются обязательными для выполнения лабораториями, аккредитованными (аттестованными) на проведение санитарно-микробиологических исследований воды. Руководство по качеству аккредитованной испытательной лаборатории должно включать или иметь ссылки на процедуры, описанные в методических указаниях.

Документальное представление результатов выполнения методик и процедур, содержащихся в методических указаниях, является неотъемлемой частью при подтверждении технической компетенции лабораторий, аккредитуемых в области микробиологических исследований воды.

2. Нормативные ссылки

1. ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа».

ГАРАНТ:

Приказом Ростехрегулирования от 15 октября 2009 г. N 457-ст применение на территории РФ ГОСТ 18963-73 прекращено с 1 июля 2011 г. в части раздела 1 «Метод отбора, хранения и транспортирования проб воды», в связи с утверждением и введением в действие ГОСТ Р 53415-2009 «Вода. Отбор проб для микробиологического анализа»

2. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

3. ГОСТ Р ISO/МЭК 17025-2000 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».

4. ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р ИСО 7218-2008 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям», утвержденный приказом Ростехрегулирования от 18 декабря 2008 г. N 480-ст

5. XI Государственная Фармакопея СССР. — М., 1998.

6. Инструкции по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности. — М., 1987.

7. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. — МЗ СССР.- М., 1980.

8. Методические рекомендации по контролю стерилизации с использованием индикаторов стерилизации НПФ «Винар» N 11-8\03-54 от 11.06.93-МЗ РФ.

9. МУ 2.1.4. Методические указания по внедрению и применению санитарных правил и норм СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

10. МУК 4.2.1018-01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

11. МУК 4.2.557-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского питания и лечебного, их компонентов».

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Номер названных методических указаний следует читать как «МУК 4.2.577-96»

12. МУК 4.2.734-99 «Микробиологический мониторинг производственной среды».

13. ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы». — МЗ СССР, 1985.

14. Приказ N 720 Минздрава СССР от 31 июля 1978 г., п.4 «Мероприятия, обеспечивающие асептические условия при посевах».

15. Приказ Минздрава РФ от 07.02.00 N 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

16. Руководство Министерства здравоохранения Российской Федерации Р 3.1.683-98 «Использование ультрафиолетового излучения для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях». — М., 1998.

ГАРАНТ:

Взамен вышеназванного Руководства действует Руководство Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях», утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.

17. Руководство 2.2.755-99 «Гигиенические критерии оценки и классификации условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса».

ГАРАНТ:

Взамен Руководства Р.2.2.755-99 действует Р 2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда», утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июля 2005 г.

18. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. Утв. приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83.

19. Система аккредитации испытательных лабораторий (центров) государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации. — М., 1997;

20. СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». — М., 1999.

21. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». — М., 1996.

22. ФС 42-3377-97 «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ — агар)».

23. ФС 42-3378-97 «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ — бульон)».

24. ФС 42-3504-97 «Питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (агар Эндо)».

25. ФС 42-3588-98 «Питательная среда для выделения сальмонелл сухая (висмут-сульфит агар)».

Использованные документы международного уровня указаны в разделе «Библиография».

3. Термины и определения

1. Бокс (боксированное помещение) — изолированное помещение с тамбуром (предбоксником).

2. Бокс биологической безопасности (ламинарное укрытие, ламинарный шкаф) — конструкция, используемая для физической изоляции (удержания и контролируемого удаления из рабочей зоны) микроорганизмов с целью предотвращения возможности заражения персонала и контаминации воздуха рабочей зоны и окружающей среды.

3. Запас рабочей культуры — культура эталонного штамма в условиях временного хранения (полужидкий агар, 4-8 °С).

4. Запас эталонной культуры — культура эталонного штамма в условиях длительного хранения (-70 °С, жидкий азот).

5. Культура для целевого использования — культура эталонного штамма, прошедшая не более 2 пассажей после высева со среды временного хранения (из запасов рабочей культуры), предназначенная для использования в анализе.

6. Лиофилизированная культура — лиофильно высушенная культура эталонного штамма.

7. Патогенные биологические агенты (ПБА) — патогенные для человека микроорганизмы (бактерии, вирусы, хламидам, риккетсии, простейшие, грибы, микоплазмы), генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения (токсины), гельминты, а также материал, подозрительный на содержание перечисленных агентов (включая кровь, другие биологические жидкости и объекты окружающей среды).

8. Посевная — рабочее помещение, предназначенное для выполнение # первого этапа санитарно-микробиологического исследования воды: концентрирования, разведения и/или посева в питательные среды.

9. Посевная доза — объем конкретного разведения, содержащий необходимое для посева количество жизнеспособных клеток тестового микроорганизма.

10. Разбавитель — жидкость определенного состава, служащая для приготовления серийных разведений исследуемой воды или модельных бактериальных культур.

11. Субкультура — культура бактерий, полученная путем пассажа через полноценные питательные среды.

Информация об изменениях:

Изменением 1 в раздел 4 настоящих Методических указаний внесены изменения

4. Общие положения организации внутреннего контроля качества санитарно-микробиологического исследования воды

Ведущим аспектом деятельности современной лаборатории является разработка Системы качества и обеспечение ее функционирования.

Система качества — это совокупность организационной структуры, методик, процессов и ресурсов, необходимых для осуществления общего руководства качеством (ISO 8401: 1994-04-01).

Система качества охватывает широкий спектр позиций, начиная от нормативно-методической документации, всесторонне регламентирующей деятельность лаборатории, ее планировки и технического оснащения, квалификации, численности и расстановки кадров — до организации внутреннего контроля качества выполняемых анализов.

Согласно МУ 2.1.4.682-97 по внедрению и применению СанПиН 2.1.4.559-96, внутрилабораторный (внутренний) контроль качества является обязательным звеном в обеспечении качества исследований воды.

Внутренний контроль качества микробиологических исследований — это комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на обеспечение и контроль стабильности требуемых условий развития искомого микроорганизма, а также предупреждение неблагоприятного воздействия факторов, возникающих в процессе подготовки, выполнения и оценки результатов анализа, способных повлиять на достоверность результата.

Особенностью санитарно-микробиологических исследований воды является необходимость количественной оценки полученного результата.

Специфика объекта микробиологических исследований, живого микроорганизма, обладающего индивидуальными (родовыми, видовыми, штаммовыми) свойствами и особенностями жизнедеятельности в условиях водной среды, создает независящие от исследователя проблемы в оценке точности количественного результата и обусловливает погрешность микробиологических методов, достигающую сотен процентов.

К наиболее значимым объективным факторам, влияющим на результат анализа, относятся следующие:

— Неравномерность распределения микроорганизмов, обусловливающая разброс данных при анализе двух одинаковых объемов одной пробы воды.

— Способность адсорбироваться на взвешенных веществах с образованием трудноразделимых в процессе взбалтывания комплексов, которые при посевах могут регистрироваться как один микроорганизм.

— Влияние сопутствующих микробов-антагонистов, тормозящих развитие искомых микроорганизмов при их наличии в анализируемой пробе воды.

— Возможное присутствие в исследуемой воде посторонних химических веществ либо образование их соединений с компонентами питательной среды, которые могут угнетать /стимулировать/ рост исследуемых микроорганизмов, а также влиять на изменение видовых биохимических идентификационных признаков.

— Нахождение микроорганизма в «стрессовом» состоянии под воздействием неблагоприятных условий водной среды, в результате которого затормаживается его способность к развитию.

Исходя из этого, основной задачей микробиологических исследований является создание оптимальных условий для развития выделяемого микроорганизма в целях получения надежных, сопоставимых количественных результатов.

Организация внутреннего контроля качества на всех этапах выполнения микробиологического анализа воды является основой получения качественного результата.

Основные направления организации внутреннего контроля качества:

1. Контроль за соблюдением требований к условиям проведения анализа: (лабораторные помещения, воздушная среда, температурные режимы инкубации и хранения, режимы дезинфекции и стерилизации и т.д.).

2. Выполнение регламентированных процедур ведения тестовых культур.

3. Контроль качества питательных сред.

4. Контроль качества фильтрующих материалов (или далее — фильтров).

5. Контроль качества дистиллированной воды.

6. Оценка достоверности качественного результата путем использования заведомо положительных и отрицательных контролей.

7. Оценка доверительных границ полученного количественного результата.

8. Систематический анализ результатов контрольных процедур в целях совершенствования руководства по качеству.

Структура организации внутреннего контроля качества, периодичность и частота выполняемых процедур представлены в прилож. 1, 2.

Описание процедур контроля соблюдения требований к условиям проведения анализа, ведения эталонных бактериальных культур, контроля качества питательных сред и фильтрующих материалов, постановки положительных и отрицательных контролей и др. представлены в тексте методических указаний и иллюстрированы в приложениях.

Документальное оформление результатов проведенных контрольных процедур осуществляется в произвольной форме, удобной исполнителю и наглядной для других специалистов, привлекаемых к участию в различных комиссиях по проверке работы лаборатории (по аттестации, аккредитации и др.). При этом могут быть использованы журнальные формы учета или формы отдельных контрольных листов, которые впоследствии брошюруются за определенный период времени (месяц, квартал, год) в зависимости от кратности и вида контроля.

Регистрация и хранение контрольных результатов могут осуществляться на электронных носителях.

Приведенные в приложении к методическим указаниям некоторые учетные формы носят информационный характер и даны в качестве возможного варианта учета результатов. Исключение составляют прилож. 4 и 8.1, в которых приведены формы учета, утв. Минздравом России.

В информационном прилож. 11 представлен перечень современного оборудования, применение которого будет способствовать повышению качества выполняемых санитарно-микробиологических исследований воды и надежности получаемых результатов.

Обязательным разделом внутреннего контроля качества является проведение периодического, но не реже 1 раза в год, анализа результатов выполненных контрольных процедур, с учетом которого осуществляется корректировка руководства по качеству испытательной лаборатории.

Обеспечение качества выполняемых исследований возможно только при наличии квалифицированного персонала. К работе по выполнению санитарно-микробиологических анализов воды допускаются специалисты с высшим и средним специальным медицинским/биологическим (микробиологическим) образованием, проходящие не реже 1 раза в пять лет курс повышения квалификации в объеме, определенном Минздравом России для бактериологов, с выдачей удостоверения установленного образца.

Требования к набору помещений и их размещению, организации и безопасности работ микробиологических лабораторий с патогенными биологическими агентами изложены в санитарных правилах «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». СП 1.2.731-99.

Требования к процедурам выполнения исследований и метрологическому обеспечению оборудования представлены в соответствующих нормативных документах и не являются предметом рассмотрения данных методических указаний.

Вопрос оценки достоверности количественных результатов микробиологических исследований воды на сегодняшний день в России остается не решенным. Действующий ГОСТ 27384-87, представляющий нормы погрешностей для бактериологических исследований воды, не обеспечивает возможности оценки получаемых результатов, т.к. входит в противоречие с реальными методиками анализа.

В случае возникновения проблем сопоставимости и достоверности результатов санитарно-микробиологических исследований воды ориентировочную оценку можно получить обращением к табл. ГОСТа 51446-99 «Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований», разработанного на основе международного документа ИСО 7218:96.

5. Контроль температурных режимов инкубации и хранения

5.1. Процедура контроля температуры в термостатах

Контроль температуры в термостатах проводят ежедневно перед началом работы.

Для контроля используют поверенные термометры.

Цена деления термометра не должна превышать половины величины допустимого отклонения температуры инкубации, определенного нормативно-методической документацией. Например: для температуры 37°С допустимое отклонение температуры составляет +-1°С. Для контроля температуры в термостате, поддерживающем данную температуру, необходимо использовать термометры с ценой деления не более 0,5°С. Соответственно, для температуры 44°С, при допустимом отклонении температуры +-0,5°С, цена деления контрольного термометра не должна превышать 0,25°С.

Для устранения искажения показаний термометра из-за быстрого изменения температуры в термостате при открывании дверцы, термометр помещают в пробирку с глицерином либо с расплавленным парафином. После застывания парафина подготовленный термометр можно размещать в горизонтальном положении.

Термометр размещают в центре камеры. При выявлении в процессе аттестации термостата экстремальных точек, термометры размещают в экстремальных точках.

Ежедневно перед началом работы снимают показания контрольного термометра, результаты измерений заносят в журнал (контрольный лист) и заверяют подписью исполнителя (прилож. 3).

В журнале для каждого термостата должно быть отмечено допустимое отклонение температуры с учетом требований методов, для исполнения которых используется конкретный термостат.

В случае превышения допустимых отклонений температуры сотрудник, проводящий регистрацию, должен немедленно сообщить об этом руководителю подразделения для принятия мер.

5.2. Процедура контроля температуры в холодильниках

Контроль температуры в холодильниках проводят один раз в неделю. Температура в холодильнике должна быть в пределах (4-8) °С. Для контроля используют поверенные термометры, подготовленные как указанно в п.5.1.

Термометр помещают в центр камеры холодильника.

Один раз в неделю перед началом работы снимают показания контрольных термометров, результаты измерений заносят в журнал (контрольный лист) и заверяют подписью исполнителя (прилож. 3).

В случае превышения допустимых отклонений температуры сотрудник, проводящий регистрацию, должен поставить в известность руководителя подразделения и провести регулировку для компенсации выявленных отклонений. Регулировку проводят переводом регулятора температуры холодильника в нужное положение. После приведения температуры до уровней допустимых значений, двукратно, через 4 часа и на следующий день, проводят регистрацию температуры.

После приведения к норме режима работы холодильника переходят к обычной схеме контроля температуры.

6. Контроль качества стерилизации и дезинфекции

6.1. Процедура контроля режимов паровой и суховоздушной стерилизации

Для контроля режимов стерилизации необходимо использовать три вида контроля.

Достоверность серологических методов исследования при риккетсиозах определяется качеством выпускаемых централизованно риккетсиальных антигенов. Они представляют собой очищенные и стандартизированные взвеси риккетсий Провачека, выращенных в желточных оболочках куриных эмбрионов по Коксу или культивируемых во вшах.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СЫПНОГО ТИФА
(МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ)

Методические указания об иммунологических способах диагностики риккетсиозов, составленные К.Н. Токаревичем и Л.Д. Васильевой, были изданы институтом в 1960 и 1961 годах. С тех пор накоплен большой дополнительный материал, характеризующийся введением в практику все более чувствительных и специфических методик.

В связи с эпидемиологическим и клиническим своеобразием спорадических случаев сыпного тифа (болезни Брилля-Цинссера) современные лабораторные методы диагностики этой инфекции приобрели особенно важное значение. Они позволяют не только надежно подтверждать сыпнотифозную природу заболеваний, но и решать важные вопросы эпидемиологического характера, например, выявление источника инфекции, обнаружение зараженных переносчиков, дифференцирование эпидемического (передающегося через вшей) и спорадического (рецидивного) сыпного тифа, определение иммунной прослойки к сыпному тифу среди населения и т.д. Этим способам и посвящено настоящее издание.

I. ВЫДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЫПНОГО ТИФА ОТ БОЛЬНЫХ

Возбудитель сыпного тифа — риккетсии Провачека может быть обнаружен в крови заболевшего в последние дни инкубации, в продроме и в течение всего лихорадочного периода; риккетсии исчезают из крови после падения температуры, в первые дни реконвалесценции, когда в крови больного специфические антитела достигают высокой концентрации. Наибольшее количество риккетсий циркулирует в крови в первые дни лихорадки и поэтому ранние сроки заболевания особенно перспективны для выделения возбудителя.

Риккетсии Провачека — облигатные внутриклеточные паразиты; они не растут на обычных питательных средах и могут размножаться лишь в живых или переживающих клетках. Выделение возбудителя из крови больного производят путем заражения восприимчивых лабораторных животных, обычно морских свинок, или при помощи инфицирования вшей, выращенных в лаборатории.

а) Выделение возбудителя при помощи

биологической пробы на морских свинках

Морским свинкам весом 250 граммов, которым предварительно в течение нескольких дней проверяют температуру, вводят внутрибрюшинно дефибринированную кровь больного в объеме 3 — 5 мл или взвесь в физиологическом растворе сгустка свернувшейся крови в том же объеме. (Сыворотка, отделенная от сгустка, может быть использована для иммунологического исследования.)

При наличии риккетсии Провачека в исследуемой крови подопытные морские свинки начинают лихорадить спустя примерно 5 — 15 дней и при этом теряют в весе. Лихорадочное состояние животных, хорошо воспроизводимое в цепи пассажей, продолжается от 2 — 3 до 8 — 10 дней. Ежедневное термометрирование свинок проводится ректально специальным термометром в течение 30 дней.

Длительность инкубации и лихорадочного периода, а также высота лихорадки зависят в основном от концентрации возбудителя в исследуемой крови больного.

Для подтверждения сыпнотифозной природы лихорадки у животного, после падения температуры, через 3 — 4 недели после заражения, морских свинок исследуют серологически. Наличие комплементфиксирующих антител или агглютининов к риккетсиям Провачека убеждает в специфичности заболевания. Риккетсиальная этиология перенесенной экспериментальной инфекции может быть подтверждена также испытанием иммунности свинок путем заражения их риккетсиями Провачека спустя полтора-два месяца после прекращения лихорадки.

Поддержание возбудителя на животных производится путем пассажей мозговой тканью. С этой целью морскую свинку забивают на высоте лихорадки, из черепной коробки стерильно извлекают мозг и подвергают его гомогенизации в физиологическом растворе (обычно в банке со стеклянными бусами). Введение внутрибрюшинно 1 — 2 мл 10-процентной мозговой взвеси здоровым животным воспроизводит лихорадку у последних.

При экспериментальной сыпнотифозной инфекции возбудитель визуально не обнаруживается в мазках-отпечатках из органов морских свинок. Только при внутрибрюшинном введении им концентрированных взвесей риккетсий Провачека (например, из инфицированных вшей или легких интраназально зараженных мышей) удается вызвать у животных перитонеальный риккетсиоз, а у самцов периорхит. В этих случаях в мазках-отпечатках из туника вагиналис или из соскоба с брюшины удается обнаружить возбудителя. Для сохранения и выделения риккетсий в визуальной форме мозговой взвесью лихорадящей морской свинки заражают куриные эмбрионы, белых мышей (интраназально), поддерживаемых в лаборатории вшей или культуру ткани.

б) Выделение риккетсий Провачека путем заражения переносчика

Платяная вошь является переносчиком риккетсий Провачека. Возбудитель сыпного тифа вызывает заболевание этих насекомых, заканчивающееся их гибелью. Вошь, напитавшаяся кровью сыпнотифозного больного в период риккетсиемии, уже в первые дни становится заразной. На второй-третий день после заражения при помощи иммунлюминесцентного метода (см. ниже) удается уже обнаружить в мазках из кишечников вшей единичные риккетсии. В дальнейшем наблюдается интенсивное размножение этих микроорганизмов, причем на 5 — 6 день после кровососания риккетсии в кишечнике обнаруживаются в больших количествах. Максимальное накопление их наблюдается на 8 — 10 день. Размножение возбудителя в эпителиальных клетках кишечника насекомых приводит к разрушению инфицированных клеток, что вызывает нарушение процесса пищеварения. Нередко за 1 — 2 дня до гибели вошь приобретает красный цвет вследствие проникновения крови через разрушенные клетки кишечника в полость тела. В мазках-отпечатках из кишечников больных вшей при окраске по Романовскому-Гимза или по Здродовскому обнаруживается огромное количество риккетсий Провачека в виде полиморфных, главным образом палочковидных образований. Быстрота развития риккетсиоза у вшей, так же как и гибель насекомых, зависят от интенсивности риккетсиемии у больных людей. Выделение возбудителя из крови больного может быть проведено путем непосредственного кормления лабораторных насекомых на больном.

При необходимости исследования вшей, снятых с больного или собранных в его окружении, выделение возбудителя может быть проведено двумя способами: внутрибрюшинным заражением морских свинок взвесью растертых насекомых или заражением этой же взвесью лабораторных («паспортных») вшей. Последнее осуществляется при помощи вскармливания однодневных личинок вшей через эпидермомембрану по Пшеничнову или же по методу Вейгля (при помощи микроклизм). В дальнейшем наблюдение за насекомыми проводят при помощи микроскопии окрашенных препаратов из кишечника последних.

Приведенное краткое описание приемов выделения культуры риккетсий Провачека из крови больных показывает сложность применяемых для этого методик, которые могут быть осуществлены только в обстановке специальных лабораторий.

Метод биопроб на морских свинках довольно широко применялся для выявления возбудителя в начале изучения сыпного тифа в эпоху эпидемического его распространения при классических формах этой инфекции. При заражении животных кровью таких больных на ранних днях болезни удавалось весьма часто воспроизводить экспериментальную инфекцию у морских свинок. При спорадическом же сыпном тифе (болезни Брилля) биологические пробы на морских свинках в очень редких случаях бывают положительными.

Более эффективным методом является вскармливание переносчика на больном в первые дни лихорадки. Однако и при этом способе у больных болезнью Брилля удается обнаружить риккетсии только при тяжелых формах заболеваний. При этом вследствие низкой концентрации риккетсий в крови больных в большинстве случаев при болезни Брилля удается обнаруживать их во вшах лишь после пассажа через эпидермомембрану.

Культивирование риккетсий Провачека в лабораториях необходимо для приготовления диагностикумов и вакцин, а попытки выделения новых штаммов не потеряли своего значения и в настоящее время для изучения их биологических особенностей.

II. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СЫПНОГО ТИФА

Из иммунологических способов диагностики риккетсиозов в настоящее время ведущее место занимают серологические.

При сыпном тифе серологический анализ используют как для распознавания заболеваний, так и для решения эпидемиологических вопросов, связанных с данной инфекцией.

Основным методом серодиагностики сыпного тифа является реакция связывания комплемента, которая характеризуется высокой специфичностью. Используют также реакцию агглютинации риккетсий и реакцию непрямой гемагглютинации. Постановка этих серологических проб предусмотрена отечественными официальными инструкциями. Они должны применяться в лабораториях инфекционных больниц и санэпидстанций. Согласно утвержденным Минздравом СССР Инструктивно-методическим указаниям (N 310 от 23.04.1968) с целью наиболее полного выявления больных сыпным тифом серологическому обследованию должны подвергаться:

лица, лихорадящие в течение 5 дней и более с диагнозами, не позволяющими полностью отвергнуть сыпной тиф;

провизорно госпитализированные с подозрением на сыпной тиф;

лица, бывшие в контакте с заболевшими сыпным тифом, в том числе:

а) при отсутствии у них педикулеза — перенесшие в течение последних 3-х месяцев какое-либо лихорадочное заболевание;

б) при наличии педикулеза — все находившиеся в контакте с больными сыпным тифом.

У сыпнотифозных больных, не леченных антибиотиками, специфические антитела в крови могут быть обнаружены в невысоких титрах начиная с 5 — 7 дня болезни; к 10 дню они могут быть выявлены почти у всех больных, причем титры антител достигают наивысшего уровня к 15 — 20 дню от начала лихорадки, после чего постепенно снижаются. При получении негативного ответа или положительной реакции в низких титрах при первом обследовании серологическое исследование необходимо повторить через 3 — 5 дней.

Кроме перечисленных серологических реакций, для серодиагностики сыпного тифа используют иммунлюминесцентный метод исследования, а также реакцию преципитации. Весьма чувствительной пробой является реакция нейтрализации токсической субстанции риккетсий, позволяющая выявлять наличие в крови больных и болевших вируснейтрализующих антител. Эта реакция может быть применена лишь в специализированных лабораториях, т.к. она ставится с живыми риккетсиями, содержащими токсическое вещество.

Для серологических исследований кровь берут в стерильную пробирку из локтевой вены в количестве 3 — 5 мл. Ее свертывают в термостате при 37° в течение 15 — 30 минут, а для отстаивания сыворотки пробирку помещают в комнатный холодильник. В тех случаях, когда взять кровь из вены не удается (например, у детей), кровь берут из пальца.

Кончик пальца протирают спиртом и прокалывают иглой, кровь набирают микропипеткой 0,2 мл и вносят в пробирку с 1,8 мл стерильного физиологического раствора, содержащего 0,25% лимоннокислого натрия, что соответствует разведению сыворотки 1:10. Для осаждения форменных элементов взвесь центрифугируют при 1 — 2 тысячах об./мин. в течение 5 — 10 минут или оставляют в рефрижераторе до следующего дня.

При невозможности проведения исследований на месте сыворотки пересылают в лабораторию в запаянных ампулах.

Сыворотки могут быть доставлены также и в высушенном виде на фильтровальной бумаге или на стекле. В первом случае 0,2 — 0,4 мл прозрачной (не содержащей эритроцитов) сыворотки наносят градуированной пипеткой на фильтровальную бумагу и высушивают при комнатной температуре. В лаборатории участок бумаги с нанесенной сывороткой вырезают, измельчают ножницами и помещают в пробирку с физиологическим раствором, взятым в таком объеме, чтобы получить исходное разведение сыворотки 1:10. В термостате при 37° в течение часа происходит полное растворение сыворотки; ее отсасывают и используют для постановки реакции по обычной методике.

Высушивание на стекле проводят в соответствии с инструкцией Министерства здравоохранения СССР, предложенной для серодиагностики сифилиса: на тщательно вымытое предметное стекло наносят 0,2 мл сыворотки, которая свободно растекается по поверхности при покачивании стекла. Последнее накрывают чашкой Петри и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Высохшую сыворотку соскабливают и помещают в пакетик. В день постановки реакции содержимое пакетика высыпают в пробирку и заливают 1,8 мл физиологического раствора, что создает разведение 1:10. Пробирки ставят на час в термостат, после чего сыворотку инактивируют и готовят необходимые разведения.

Примечание. С этими сыворотками можно ставить реакции связывания комплемента и гемагглютинации, но они непригодны для постановки реакции агглютинации.

Каждую пробу сыворотки должны сопровождать следующие данные о больном: фамилия, имя, возраст, профессия (место работы), день болезни, дата взятия крови, предполагаемый диагноз, анамнез в отношении перенесения сыпного тифа в прошлом.

1. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

С АНТИГЕНАМИ ИЗ РИККЕТСИЙ ПРОВАЧЕКА

Широкое применение серологических методов исследования со специфическими антигенами из риккетсий Провачека стало возможным благодаря разработке способов культивирования и накопления риккетсий.

Достоверность серологических методов исследования при риккетсиозах определяется качеством выпускаемых централизованно риккетсиальных антигенов. Они представляют собой очищенные и стандартизированные взвеси риккетсий Провачека, выращенных в желточных оболочках куриных эмбрионов по Коксу или культивируемых во вшах.

Риккетсиальные антигены, применяемые в серологических реакциях, выпускают в виде корпускулярных взвесей, растворимых субстанций, или цельных антигенов, состоящих из корпускул риккетсий и растворимых фракций.

Корпускулярные антигены применяют для реакции агглютинации, цельные же и растворимые — для реакции связывания комплемента, а также для реакции преципитации.

Ввиду малой стойкости жидких антигенов (лизис и аггрегация риккетсий) в настоящее время их выпускают в сухом виде в запаянных ампулах, что обеспечивает неизменность их свойств на протяжении длительного времени при хранении при +4 — +10 °С.

В день постановки реакции антигены разводят физиологическим раствором согласно указаниям на этикетке ампул или в прилагаемом к препарату наставлении.

Сухие антигены, подвергнутые лиофильному высушиванию, должны иметь вид сухого порошка, хорошо отстающего от стенок ампул, или сухой пористой массы. Если содержимое ампулы плохо растворяется и выпадает в виде хлопьев, это указывает на недоброкачественность антигена (дефекты высушивания или нарушение вакуума).

Срок годности диагностикума указывается на этикетке ампул: по прошествии его антигены подлежат обязательной проверке с 2 — 3 заведомо положительными сыворотками средних титров и с 2 — 3 отрицательными сыворотками.

Каждая вновь полученная серия антигена перед введением ее в опыт также должна быть проверена с заведомо положительными и отрицательными инфекционными или иммунсыворотками.

а) Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических комплементсвязывающих антител.

Сущность реакции заключается в связывании комплемента специфически комплексом (антиген + антитело), что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании комплекса антиген + антитело последний связывает комплемент и вследствие этого после добавления гемолитической системы не возникает гемолиза. Если же комплекс антиген + антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, положительный результат РСК характеризуется отсутствием или задержкой гемолиза, а отрицательный — феноменом гемолиза (рис. 1 — здесь и далее рисунки не приводятся).

Реакцию связывания комплемента можно ставить при 37° и путем длительного связывания на холоде (при +4°). Последний способ чувствительнее первого, но требует несколько большего срока для завершения исследования (около суток); поэтому для диагностических целей обычно применяют метод постановки РСК в условиях термостата, что позволяет закончить исследование в течение одного дня.

Для постановки РСК необходимо 5 ингредиентов: 1) испытуемая сыворотка; 2) антиген; 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) эритроциты барана. Реакцию ставят в общем объеме 1 мл, т.е. берут по 0,2 каждого ингредиента. Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов.

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в сухожаровом шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают стерильным физиологическим раствором (0,85-процентный раствор химически чистой поваренной соли в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56 — 58° для разрушения комплемента.

Риккетсиальный антиген и гемолитическую сыворотку титруют те институты, которые их готовят. В соответствии с данными титрования на этикетке сухого антигена указывают объем жидкости, в котором он должен быть растворен, а на этикетке гемолитической сыворотки указывают ее титр.

Комплемент употребляют или сухой (выпускаемый в ампулах), или жидкий. Для получения последнего берут по 2 — 3 мл крови из сердца нескольких морских свинок в стерильную посуду и после отстаивания сыворотки ее разливают в пробирки и хранят в леднике (при +4°). Комплемент консервируют химическими смесями, например, 0,05 г сернокислого натрия и 0,04 г кристаллической борной кислоты на 1 мл сыворотки (Гинзбург, Калинин, 1947), или замораживанием в рефрижераторе при температуре минус 20°. Сухой комплемент применяется согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Как свежий, так и консервированный комплемент следует титровать каждый раз перед постановкой опыта.

При работе с риккетсиальными антигенами основным разведением комплемента является обычно 1:10.

Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах; это сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. В опыт гемолитическую сыворотку вводят в тройном титре: например, рабочий титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,2 мл разведений сывороток, начиная с 1:1000; в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,2 мл и по 0,2 мл 3-процентной взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,4 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при 37° в течение часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

¦ \Разведения ¦ 1:1000 ¦ 1:1200 ¦ 1:1600 ¦ 1:2000 ¦ 1:2400 ¦ 1:2800 ¦ 1:3000 ¦ 1:3200 ¦ 1:3600 ¦ 1:4000 ¦

¦ Гемолитическая ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

¦ 3-процентная ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

¦ Комплемент в ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

¦ Физиологический ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦

¦ Титр гемолитической сыворотки 1:2000 ¦

Бараньи эритроциты. Кровь, взятую из яремной вены барана, дефибринируют в банке с бусами, процеживают через стерильную марлю и хранят в леднике. Перед опытом дефибринированную кровь отмывают при помощи центрифугирования трижды физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят 3-процентную взвесь эритроцитов. Ввиду малой устойчивости эритроцитов они могут сохраняться в условиях ледника без изменения только в течение 3 — 5 дней. В связи с этим предложены следующие методы их консервирования.

1) К 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл раствора, состоящего из физиологического раствора 100 мл, борной кислоты 4 г и глюкозы 6 г. Раствор кипятят в водяной банке по 20 минут 3 дня подряд. Консервированные указанным способом эритроциты могут сохраняться в рефрижераторе 3 — 4 месяца (Е.М. Голиневич).

2) Консервирование эритроцитов проводят также путем непосредственного соединения взятой от барана крови с консервантом, приготовленным по прописи Алсвера: хлористый натр 4,2 г, глюкоза 20,5 г, лимоннокислый натр 8 г, дистиллированная вода 1000 мл. pH раствора должен быть 6,2. Раствор стерилизуют текучим паром или кипятят в водяной бане по 30 минут 3 дня подряд. Кровь от барана берут в стерильные флаконы, в которые предварительно наливают равный объем этого консерванта.

Консервированные эритроциты в день постановки опыта трехкратно отмывают физиологическим раствором, как указано выше.

ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Накануне постановки основного опыта РСК проводят следующую подготовительную работу:

1. Отсос от сгустков крови исследуемых сывороток и инактивирование их при 56° в течение 30 минут.

2. Взятие крови у свинок для получения комплемента.

3. Взятие крови у барана.

В день постановки опыта производят:

1. Отмывание бараньих эритроцитов.

2. Титрование комплемента.

ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА

Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы.

Титрование начинают с приготовления гемолитической системы, которая состоит из равных объемов 3-процентной взвеси отмытых эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в разведении, соответствующем тройному ее титру. После тщательного смешивания эритроцитов с гемолитической сывороткой смесь (гемосистему) ставят в термостат при 37° на 30 минут.

На протяжении этого времени готовят разведения комплемента, начиная с исходного 1:10. В ряд пробирок разливают микропипеткой различные дозы разведенного комплемента с интервалом 0,01 мл. Так как титрование комплемента ведется в отсутствии антигена, то объем жидкости в каждой пробирке доводится до 0,6 мл физиологическим раствором, а затем добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, выдержанной в термостате 30 минут. Пробирки тщательно встряхивают и ставят в термостат на 30 минут, после чего немедленно учитывают результат (табл. 2).

ПРИМЕР ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Комплемент в разведении
1:10

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами; почти полная задержка (следы гемолиза) обозначаются тремя крестами; частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) — одним крестом.

Единицей комплемента считают то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 0,05 разведения комплемента 1:10. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере 0,06 мл. Под рабочей дозой комплемента понимают количество его, содержащееся во второй пробирке с полным гемолизом, т.е. одна полная единица комплемента при проведении связывания в термостате при 37° в течение часа или две полные единицы при холодном связывании (в рефрижераторе при +4 °С в течение 18 часов). В приведенном примере титрования комплемента рабочая доза при горячем способе связывания равна 0,06 на каждую пробирку, при холодном 0,06 х 2 = 0,12.

Титрование комплемента можно производить и без применения микропипетки. В этом случае разведения комплемента предварительно приготавливают в отдельном штативе. В ряд пробирок разливают однокубиковой пипеткой нарастающие дозы комплемента (разведенного 1:10), начиная с 0,1 до 1,0 мл, затем в каждую пробирку добавляют физиологический раствор с таким расчетом, чтобы довести объем разведенного комплемента до 2 мл (табл. 3).

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РАЗВЕДЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

ДЛЯ ТИТРОВАНИЯ ЕГО РАБОЧЕЙ ДОЗЫ

Комплемент, разведенный 1:10

Объем разведенного комплемента

Для титрования рабочей дозы комплемента в ряд пробирок наливают по 0,2 мл комплемента различных разведений из пробирок предварительного ряда, а затем к каждому разведению добавляют по 0,4 мл физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы, выдержанной в термостате 30 минут (табл. 4). После тщательного встряхивания штатив с пробирками ставят в термостат на 30 минут; по истечении этого времени производят учет результатов, как указано выше.

ТИТРОВАНИЕ РАБОЧЕЙ ДОЗЫ КОМПЛЕМЕНТА

Комплемент 1:10 в
разведениях

(из предварительного
ряда пробирок)

После выбора рабочей дозы комплемента производят расчет нужного количества его для основного опыта. Например, для опыта, рассчитанного на 100 пробирок, общий объем комплемента в его рабочей дозе составит 0,2 мл х 100 = 20 мл. При рабочей дозе комплемента 0,06 мл на 1 пробирку следует взять на 100 пробирок 0,06 мл х 100, т.е. 6,0 мл комплемента, разведенного 1:10, или 0,6 мл неразведенного. Физиологического раствора на 1 пробирку требуется 0,2 мл — 0,06 мл = 0,14 мл, а на 100 пробирок 0,14 мл х 100, что составляет 14 мл. Таким образом, на опыт в 100 пробирок требуется 6 мл комплемента, разведенного 1:10, и 14 мл физиологического раствора. При расчете на неразведенный комплемент потребуется 0,6 мл его и 19,4 мл физиологического раствора.

При холодном связывании при аналогичных расчетах понадобится 1,2 мл неразведенного комплемента и 18,8 мл физиологического раствора.

ПОСТАНОВКА ОСНОВНОГО ОПЫТА

Испытуемые сыворотки, инактивированные при 56 °С 30 минут, разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки по 0,2 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,2 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе. После тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат на 1 час при 37 °С или в ледник при +4 °С на 16 — 20 часов (1-я фаза реакции).

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1) контроль всех исследуемых сывороток (0,2 сыворотки в исходном разведении + 0,2 комплемента в рабочей дозе + 0,2 физиологического раствора);

2) контроль антигена (0,2 антигена + 0,2 комплемента в рабочей дозе + 0,2 физиологического раствора);

3) контроль комплемента (0,2 комплемента в рабочей дозе + 0,4 физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (к 0,6 физиологического раствора добавляют 0,4 гемолитической системы).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями.

Вторая фаза реакции проводится при 37 °С. В каждую пробирку опыта и контроля добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате в течение 30 минут. Пробирки тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20 — 30 минут в зависимости от скорости гемолиза эритроцитов в контролях (табл. 5).

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК

Конт-
роль
компле-
мента

Конт-
роль
гемо-
системы

Физиологиче-
ский раствор

При 37 °С на час или в холодильник при 4° на 16 — 20 час.

Гемолитиче-
ская система

Физиологиче-
ский раствор

В термостат на 30 мин. при 37 °С

В пробирках с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.

Учет результатов рекомендуется проводить спустя 1 час после выдерживания пробирок при комнатной температуре.

Оценка главного опыта заключается, как и при титровании комплемента, в определении степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз.

Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, характеризующееся четырьмя или тремя крестами.

При резко положительных результатах феномен задержки гемолиза сохраняется на протяжении ряда часов.

Результаты реакции считаются достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует.

Минимальным диагностическим титром реакции связывания комплемента при сыпном тифе считается разведение сыворотки 1:160 при условии его повышения в динамике заболевания. У сыпнотифозных больных комплементсвязывающие антитела к риккетсиям Провачека в диагностических титрах могут обнаруживаться уже в конце первой недели заболевания, причем при болезни Брилля комплементсвязывающие антитела появляются на несколько более ранних сроках, чем при эпидемическом сыпном тифе. На второй неделе, к 10 — 12 дням болезни положительная РСК обнаруживается почти у всех больных. Титры антител повышаются и достигают максимума к 15 — 20 дням болезни, после чего постепенно снижаются.

Примечание. В результате применения антибиотиков широкого спектра, в особенности на ранних сроках заболевания, может наблюдаться замедление иммуногенеза, выражающееся в более поздней и менее интенсивной выработке комплементсвязывающих антител.

Комплементсвязывающие антитела сохраняются у перенесших сыпной тиф в течение весьма продолжительных сроков — на протяжении многих лет и даже десятилетий. Благодаря этому РСК может быть использована для определения «иммунной прослойки» в населении и для проверки анамнестических данных о перенесенном заболевании.

По мере увеличения срока, прошедшего после перенесения сыпного тифа, титры комплементсвязывающих антител снижаются. Однако и низкие титры этой реакции, не достигающие диагностического уровня и не имеющие тенденции к нарастанию, должны рассматриваться как специфические, свидетельствующие об инфицированности обследуемого в прошлом.

б) Реакция агглютинации риккетсий (РАР)

Реакция агглютинации риккетсий — наиболее простой и доступный серологический метод диагностики сыпного тифа. Для постановки ее применяют корпускулярные антигены, представляющие собой очищенные взвеси риккетсий из яичных культур, из легких зараженных мышей или из инфицированных вшей.

Существует два метода постановки этой реакции: макроскопический и микроскопический.

Макроскопический способ агглютинации риккетсий.

а) Объемный способ. Реакцию ставят в пробирках в объеме 0,4 мл (к различным разведениям сыворотки в объеме 0,2 добавляют равный объем антигена). Каждый опыт обязательно сопровождается контролями исследуемой сыворотки (к 0,2 основного ее разведения добавляют 0,2 физиологического раствора) и антигена (к 0,2 антигена добавляют 0,2 физиологического раствора). Целесообразно в качестве контроля исследовать также заведомо положительную и отрицательную сыворотки. Схема постановки реакции представлена в следующей таблице (табл. 6).

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

АГГЛЮТИНАЦИИ РИККЕТСИЙ (ОБЪЕМНЫЙ СПОСОБ)

¦ \Разведения ¦ 1:50 ¦ 1:100 ¦ 1:200 ¦ 1:400 ¦ 1:800 ¦ 1:1600 ¦ Контроль ¦

¦ \сывороток ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ сыворотки ¦ антигена ¦

¦ Исследуемая ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦

¦ Антиген ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦

¦ Физиологический ¦ — ¦ — ¦ — ¦ — ¦ — ¦ — ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

Реакция проводится в условиях термостата при 37° в течение 18 — 20 часов (практически до следующего дня). Результаты ее учитывают спустя 2 часа выдерживания опыта при комнатной температуре. Положительные реакции характеризуются возникновением очень нежного и легко разбиваемого осадка (агглютината) на дне пробирок, видимого невооруженным глазом, поэтому пробирки не следует встряхивать. При чтении реакции с помощью агглютиноскопа изображение агглютината получается несколько увеличенным и особенно отчетливым на черном фоне. При отрицательных результатах содержимое пробирок останется равномерно мутным.

Оценку силы положительных реакций проводят по следующей условной шкале: полное просветление надосадочной жидкости и компактный осадок на дне обозначается тремя крестами (+++); неполное просветление при наличии четко определяемого осадка — двумя крестами (++), незначительное просветление надосадочной жидкости и слабо выраженный осадок оценивается одним крестом (+). При заключении о титре сыворотки принимают в расчет только трех- и двухкрестовые реакции.

Минимальным диагностическим титром при данном способе постановки реакции агглютинации считают разведение сыворотки 1:100 при обязательном условии полного или почти полного склеивания риккетсий, обозначаемого тремя или двумя крестами. В течение заболевания должно иметь место нарастание титра агглютининов при последующих анализах.

б) Капельный способ. Для диагностики сыпного тифа Г.С. Мосинг предложил постановку макроскопической реакции агглютинации в маленьких пробирках объемом 0,8 — 1,0 мл, что позволяет более экономно расходовать риккетсиозный антиген. Разведение исследуемых сывороток производится следующим образом.

В первую пробирку помещают 4 капли физиологического раствора, а во все остальные — по 3 капли. Затем в первую пробирку добавляют одну каплю сыворотки и после смешивания 3 капли переносят во вторую пробирку и т.д. Таким образом получают разведения сыворотки от 1:5 до 1:320. Далее в каждую пробирку добавляют (также каплями) равное количество антигена, представляющего собою суспензию убитых риккетсий Провачека, полученных из кишечников зараженных вшей. В конечном счете сыворотка оказывается разведенной от 1:10 до 1:640.

Контролем исследуемой сыворотки является разведение ее в физиологическом растворе 1:10. Контроль антигена представляет собою смесь трех капель взвеси риккетсий и трех капель физиологического раствора.

Штативы с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 36° на 20 — 24 часа. Учет реакции может производиться без агглютиноскопа через 2 — 3 часа после того, как пробирки вынуты из термостата. Положительная реакция характеризуется темно-коричневым осадком с неправильными краями (в виде зонтика) и прозрачной жидкостью над осадком. Характер агглютината мелкозернистый. При отрицательном результате осадок не образуется и жидкость остается мутной. Титр 1:40 является диагностическим.

При повторных заболеваниях сыпным тифом титры реакции агглютинации риккетсий в этой модификации обычно невысоки (в пределах 1:40 — 1:160); в сыворотках лиц, болеющих впервые, агглютинины обнаруживаются в более значительных титрах — порядка 1:80 — 1:640 и выше.

Микроскопический способ, предложенный Вейглем, заключается в том, что различные разведения испытуемой сыворотки наносят петлей в виде маленьких капель на покровное стекло. К каждой капле тонкооттянутой пипеткой добавляют такую же каплю антигена. Края покровного стекла смазывают вазелином и накладывают на предметное стекло с углублением. Препарат помещают на 2 часа в термостат или оставляют до следующего дня при комнатной температуре. Учет реакции производят под микроскопом. Позже был предложен принцип цветной микроагглютинации (Жиру). В СССР он разработан А.В. Пшеничновым и сотр. (1944). Для этой реакции применяют хорошо очищенную взвесь риккетсий Провачека в концентрации 1 млрд. по бактерийному стандарту. Разведения исследуемых сывороток делают в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В каждую из пробирок вносят одну каплю антигена. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37° на 2 часа, а затем оставляют до следующего дня в прохладном месте.

Через 18 — 20 часов, после осторожного встряхивания пробирок наносят на предметное стекло тонкой пастеровской пипеткой каплю из каждой пробирки (начиная с последней). После полного высыхания капель мазки фиксируют смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Учет реакции производят с помощью иммерсионной системы микроскопа. При положительной реакции в мазках видны окрашенные в лиловый цвет конгломераты склеенных риккетсий; негативные результаты характеризуются наличием одиночных рассеянных риккетсий.

Реакция считается положительной в разведении сывороток, начиная с 1:160 при трех или двухкрестовой ее интенсивности.

Для использования микроскопического способа требуется применение особо тщательно очищенных взвесей риккетсий, т.к. последние склонны к спонтанному склеиванию, что затрудняет правильный учет результатов.

Микроскопические способы агглютинации были предложены в целях экономии антигена в тот период, когда еще не были освоены широко методы культивирования риккетсий.

Агглютинины нестойки и относительно быстро инактивируются при хранении, поэтому РАР необходимо ставить со свежими сыворотками.

Преимущества ее заключаются в простоте и технической доступности. Недостатком надо считать не всегда выраженную четкость результатов, что не исключает некоторой субъективности в оценке реакции.

Агглютинины к риккетсиям Провачека у лиц, перенесших сыпной тиф, сохраняются лишь в течение ближайшей реконвалесценции и редко обнаруживаются в крови переболевших через 8 — 10 месяцев. Поэтому РАР непригодна для отдаленной ретроспективной диагностики сыпнотифозной инфекции.

в) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Реакция непрямой гемагглютинации основана на способности эритроцитов, на поверхности которых адсорбирован антиген, агглютинироваться специфической иммунной сывороткой.

Для постановки РНГА требуются следующие ингредиенты: антиген, инактивированные сыворотки и эритроциты.

В качестве антигена для РНГА используют эритроциты барана (или человеческие 0 группы крови), на поверхности которых адсорбирован риккетсиозный антиген. Последний готовится из очищенных взвесей риккетсий Провачека, прокипяченных в щелочном растворе. Риккетсиозный антиген титруют с целью определения его рабочей дозы, что указывается в наставлении к выпускаемому препарату.

Испытуемую сыворотку готовят так же, как и для РСК, ее отделяют без эритроцитов от сгустка крови и инактивируют при 56° в течение 30 минут. Так как человеческая сыворотка может содержать гетерогенные гемагглютинины в отношении эритроцитов барана, то она должна быть обязательно истощена бараньими эритроцитами.

Эритроциты барана 2 — 3 раза отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования. Бесцветную надосадочную жидкость удаляют, а осадок используют для РНГА.

ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ РНГА

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пробирках или на пластинках с лунками, тщательно вымытых и высушенных.

Накануне постановки реакции проводят: 1. Инактивирование исследуемых сывороток (при 56 °С — 30 минут) и 2. Взятие крови у барана.

В день постановки реакции: 1) отмывают эритроциты барана; 2) адсорбируют антиген на эритроциты барана; 3) извлекают нормальными эритроцитами барана гетерогенные гемагглютинины из исследуемых сывороток.

1. Приготовление адсорбированного на эритроцитах антигена. Сухой антиген перед постановкой реакции растворяют в том объеме физиологического раствора, который указан на этикетке ампулы. Затем 4 мл его переносят пипеткой в центрифужную пробирку и добавляют 0,1 мл отмытых эритроцитов барана. После тщательного смешивания центрифужную пробирку ставят в термостат при 37° на 1 час. Для лучшей адсорбции антигена на поверхности эритроцитов взвесь встряхивают каждые 10 минут. По истечении часа антиген центрифугируют 10 — 15 минут при 2000 — 2500 об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов добавляют 10 мл физиологического раствора и тщательно перемешивают. Таким образом получают 1-процентную взвесь эритроцитов с адсорбированным на их поверхности антигеном.

2. Адсорбцию гетерогенных гемагглютининов проводят путем смешивания исследуемых сывороток с отмытым осадком эритроцитов барана в объеме, соответствующем половине объема взятой сыворотки. Например, в центрифужную пробирку наливают 0,9 мл физиологического раствора, 0,1 мл исследуемой инактивированной сыворотки и добавляют 0,05 мл эритроцитов барана. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 минут при периодическом встряхивании. Затем сыворотку центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают в чистую пробирку, а осадок сбрасывают.

Техника постановки реакции заключается в следующем: исследуемые сыворотки (инактивированные и адсорбированные нормальными бараньими эритроцитами) разводят, начиная с 1:250; к каждому разведению сыворотки в объеме 0,4 добавляют 0,1 мл антигена, т.е. 1-процентной взвеси эритроцитов с адсорбированным на их поверхности риккетсиозным антигеном.

Опыт сопровождается следующими контролями:

1. Контроль сыворотки: к 0,4 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:250 добавляют 0,1 мл 1-процентной взвеси нормальных эритроцитов барана.

2. Контроль антигена: к 0,4 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл антигена.

3. Контроль эритроцитов барана: к 0,4 мл физиологического раствора добавляют по 0,1 мл 1-процентной взвеси эритроцитов барана (табл. 7). После тщательного перемешивания ингредиентов опыт выдерживают в термостате при 30° в течение 16 — 20 часов.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РНГА

¦ \Разведения ¦ 1:250 ¦ 1:500 ¦ 1:1000 ¦ 1:2000 ¦ 1:4000 ¦ 1:8000 ¦ 1:16000 ¦ 1:32000 ¦ 1:64000 ¦ Контроль ¦

Источник — http://base.garant.ru/4178946/

Источник — http://www.alppp.ru/law/zdravoohranenie—fizicheskaja-kultura-i-sport—turizm/zdravoohranenie/69/laboratornaja-diagnostika-sypnogo-tifa-metodicheskie-ukazanija.html

antfiksa

Share
Published by
antfiksa

Recent Posts

Как избежать коронавируса? Часто задаваемые вопросы и ответы.

Мойте руки как можно чаще, прикрывайте рот и нос на публике, избегайте скопления людей, сохраняйте…

57 минут ago

Беспроводной ирригатор Waterpik WP-450.

Беспроводной ирригатор Waterpik WP-450. Вы ищете беспроводной ирригатор с большим резервуаром для воды ? Тогда вы попали в…

1 час ago

Стационарный ирригатор Oral-B Professional Care Oxyjet MD20.

Стационарный ирригатор Oral-B Professional Care Oxyjet MD20. Ирригатор Oral-B MD20 - интересное предложение, особенно для…

1 час ago

Стационарный ирригатор Waterpik WP-160 Ultra Plus.

Стационарный ирригатор Waterpik WP-160 Ultra Plus. Waterpik WP-160 - это улучшенная версия известного топового ирригатора WP-100 . Это одна из…

1 час ago

Беспроводной ирригатор Panasonic EW1511

Беспроводной ирригатор Panasonic EW1511 Еще одна модель в нашем рейтинге - это тоже предложение от…

1 час ago

Стационарный ирригатор Waterpik WP-660.

Стационарный ирригатор Waterpik WP-660. Это еще одна модель ирригатора Waterpik в этом списке. На этот раз…

1 час ago